Раздел "Генная инженерия"

Введение гена в клетку

Регуляция экспрессии генов  эукариот

Особенности организации генома эукариот

У эукариотических организмов механизм регуляции транскрипции гораздо более сложен. В результате клонирования и секвенирования генов эукариот обнаружены специфические последовательности, принимающие участие в транскрипции и трансляции.

Для эукариотической клетки характерно:

1. Наличие интронов и экзонов в молекуле ДНК.

2. Созревание и-РНК - вырезание интронов и сшивка экзонов.

3. Наличие регуляторных элементов, регулирующих транскрипцию, таких как: а) промоторы - 3 вида, на каждый из которых садится специфическая полимераза. РНК-полимераза I реплицирует рибосомные гены, РНК-полимераза II - структурные гены белков, РНК-полимераза III - гены, кодирующие небольшие РНК. Промоторы РНК-полимеразы I и РНК-полимеразы II находятся перед участком инициации транскрипции, промотор РНК-полимеразы III - в рамках структурного гена; б) модуляторы - последовательности ДНК, усиливающие уровень транскрипции; в) (энхансеры) усилители - последовательности, усиливающие уровень транскрипции и действующие независимо от своего положения относительно кодирующей части гена и состояния начальной точки синтеза РНК; г) терминаторы - специфические последовательности, прекращающие и трансляцию, и транскрипцию.

Эти последовательности по своей первичной структуре и расположению относительно инициирующего кодона отличаются от прокариотических, и бактериальная РНК-полимераза их не "узнает". Таким образом, для экспрессии эукариотических генов в клетках прокариот нужно, чтобы гены находились под контролем прокариотических регуляторных элементов. Это обстоятельство необходимо учитывать при конструировании векторов для экспрессии.

Структурные гены, обеспечивающие жизнедеятельность эукариотической клетки, обычно транскрибируется в большинстве активно функционирующих клеток. В то же время,  специфические гены, уникальные тех или иных тканей или органов, транскрибируются и транслируются только в определенных клетках. Например, гены, кодирующие α- и β-субъединицы гемоглобина взрослого человека, экспрессируются исключительно в клетках - предшественниках эритроцитов. Число разных мРНК, специфичных для разных клеток, варьирует от единиц до десятков.

Способность клеток включать (активировать) или выключать (ингибировать) структурные гены крайне важна для поддержания клеточной специфичности и экономного расходования энергетических ресурсов. Отсюда и многообразие факторов транскрипции, имеющих белковую природу. Многие из них связываются непосредственно с нуклеотидной последовательностью длиной менее 10 п.н., называемой по-разному: боксом, модулем, элементом инициации, регуляторным элементом. В отличие от прокариот у эукариот опероны в большинстве своем отсутствуют, т. е. каждый эукариотический структурный ген имеет свой собственный набор регуляторных элементов. Существенную роль в регуляции транскрипции у эукариот, помимо опосредованной взаимодействием между ДНК и белками, играют также белок-белковые взаимодействия.
Несмотря на индивидуальность набора регуляторных элементов у структурных генов эукариот, каждый из них имеет промоторный участок (ТАТА-бокс, или бокс Хогнесса) из восьми нуклеотидов, включающий последовательность TATA; последовательность ССААТ (САТ-бокс); участок из повторяющихся динуклеотидов GC (GC-бокс). Эти элементы находятся на расстоянии 25, 75 и 90 п.н. от сайта инициации соответственно:

Транскрипция структурного гена эукариот начинается со связывания с ТАТА-боксом фактора транскрипции, который представляет собой комплекс по крайней мере из 14 белков. Затем с ним и участками ДНК, примыкающими к ТАТА-боксу, связываются другие факторы транскрипции, и, наконец, со всем этим транскрипционным комплексом связывается РНК-полимераза II. Затем при участии дополнительных факторов происходит инициация транскрипции в точке +1 . Если последовательность TATA отсутствует или существенно изменена, то транскрипция структурного гена становится невозможной.

Пример регуляции транскрипции путем взаимодействия специфических белковых факторов с ТАТА-боксом на этих рисунках ниже.


На первой фотографии показано слабое свечение свечение маркера, показывающего, что синтез идет, но не интенсивно, так как TATA-бокс не активирован.



На второй фотографии клетка светится интенсивно, она буквально нафарширована специфичным белком, синтез которого был запущен активацией TATА-бокса. Продукция белка была настолько высокой, что плашки с клетками даже в видимом свете были пурпурного цвета.

Идентифицированы также факторы транскрипции, специфичные для регуляторных элементов ССААТ и GC, но пока неясно, как ДНК-белковые взаимодействия могут влиять в этом случае на эффективность транскрипции, если элементы расположены на расстоянии более 75 п.н. от сайта инициации. Кроме того, на расстоянии сотен и даже тысяч пар оснований от сайта инициации находится энхансерная последовательность, которая многократно повышает скорость транскрипции структурных генов. Специфическое сворачивание ДНК при формировании нативной структуры сближает удаленные регуляторные элементы и соответствующие структурные гены. Кроме того, факторы транскрипции, которые связываются с определенными энхансерами и регуляторными элементами, могут образовывать цепочку, соединяющую удаленные друг от друга сайты.

Некоторые репрессированные (неэкспрессирующиеся) гены активируются каскадом событий, который запускается каким-либо специфическим внеклеточным сигналом, например повышением температуры или синтезом гормона. Гормон, поступив в кровоток, связывается с рецепторами специфических клеток, облегчающими его проникновение в клетку. Оказавшись в клетке, гормон вступает во взаимодействие с одним из клеточных белков и изменяет его конформацию. В таком измененном состоянии белок проникает в ядро и связывается со специфическим регуляторным элементом, который инициирует транскрипцию соответствующего гена. Существуют также белки, которые, взаимодействуя с регуляторными элементами, блокируют транскрипцию.
Регуляция транскрипции у эукариот очень сложна. Структурный ген может иметь множество регуляторных элементов, которые активируются специфическими сигналами в клетках разного типа в разное время клеточного цикла. В то же время, некоторые структурные гены находятся под контролем уникального фактора транскрипции. Специфические белки могут взаимодействовать с определенными регуляторными элементами и блокировать транскрипцию или связываться со всем транскрипционным комплексом еще до инициации транскрипции или во время элонгации

Читать дальше ► генетические вектора для генной модификации растений