биотехнология, учебник

Содержание главы:


Разделы учебника:


Реклама

Раздел "Генная инженерия"

Введение гена в клетку

Регуляция экспрессии прокариотических генов

Одно из самых важных свойств гена - способность к экспрессии. За это свойство отвечают различные генетические элементы, которые мы должны встроить в векторную молекулу, несущую ген.

Многие бактериальные гены устроены таким образом, что они способны функционировать с существенно разной эффективностью. У E. coli, например, относительное содержание различных белков варьирует в очень широких пределах (от менее чем 0.1% до 2%) в зависимости от их функций; при этом каждый белок в хромосоме E. coli кодируется единственным геном. Такие вариации обусловлены действием системы контроля генной экспрессии, которая осуществляется главным образом на уровне транскрипции ДНК. Таким образом, чаще всего уровень активности гена связан с количеством синтезируемой на нем мРНК, то есть с активностью фермента РНК-полимеразы.

Последовательности ДНК, расположенные перед началом структурного гена и определяющие степень активности РНК-полимеразы, называются регуляторными последовательностями. Одна из таких последовательностей представляет собой участок ДНК, с которым связывается РНК-полимераза. Этот участок называется промотором.

Последовательность оснований промотора определяет частоту инициации синтеза иРНК, причем замена одного основания в этой последовательности может привести к уменьшению частоты инициации в 1000 раз.

Промотор может быть сильным и слабым. Сильный промотор инициирует синтез иРНК часто, слабый - гораздо реже. С другой стороны, промотор может быть регулируемым и нерегулируемым. Например, промотор β-лактамазы нерегулируемый, но сильный. Использование таких промоторов не всегда удобно. Дело в том, что большое количество белка может блокировать рост бактерий. Кроме того, интенсивная транскрипция рекомбинантной ДНК может помешать репликации плазмиды, и она будет утрачена. Поэтому удобнее использовать регулируемые сильные промоторы (индуцибельные), включение которых, а значит и синтез чужеродного белка можно осуществить, когда получена большая бактериальная масса.

Некоторые плазмидные векторы содержат промотор, работа которого регулируется температурочувствительным белковым продуктом гена-репрессора. Белок-репрессор активен при определенных температурах и блокирует действие промотора. Повысив температуру до 42 оС, можно "включить" промотор и быстро получить большое количество требуемого белка.

В качестве индуцибельных промоторов используют также Trp-промотор триптофанового оперона, который регулируется триптофановым голоданием, lac-промотор лактазного оперона, который индуцируется субстратом (лактозой) и другие.

Интенсивность транскрипции определенных структурных генов может зависеть от эффективности ее терминации, в частности, от того, как часто РНК-полимераза прекращает синтез РНК, не дойдя до этих генов. Сравнительно недавно обнаружено, что во многих оперонах Е.coli, контролирующих биосинтез аминокислот, между промотором и первым структурным геном имеется терминирующая последовательность. В определенных условиях происходит образование терминирующего сигнала, ослабляющего интенсивность транскрипции.

Это явление получило название аттенуации, а участок ДНК - аттенуатор (ослабитель). Как и репрессия, аттенуация зависит от присутствия в среде соответствующих аминокислот. Например, избыток триптофана в клетках триптофанзависимых мутантов, дефектных по репрессору, только 1 из 10 молекул РНК-полимеразы, начавших транскрипцию, преодолевает аттенуатор и считывает структуру генов. Удаление триптофана втрое повышает эффективность транскрипции генов. В отличие от репрессии, антенуация зависит не от самой аминокислоты, а от триптофанил - тРНК (аминокилоты, присоединенной к соответствующей тРНК).

На эффективность продуктивности рекомбинантной ДНК в существенной степени влияет количество копий этой ДНК в расчете на клетку. Суммарная активность экспрессируемого гена растет с ростом копийности плазмиды. Таким образом, используя многокопийные плазмиды, можно достичь сверхсинтеза нужных белковых продуктов. Обычно используемые плазмидные векторы (pBR 322 и др.) поддерживаются в клетке в количестве 20-50 копий. Сейчас исследователи имеют в своем распоряжении температурно-чувствительные мутантные плазмиды, способные накопить до одной-двух тысяч копий на клетку, не нарушая ее жизненно-важных функций. Таким образом можно достичь сверхпродукции плазмидных генов бактериальными штаммами-сверхпродуцентами.

Регуляция экспрессии у E. coli происходит также и на уровне трансляции. Последовательность оснований длиной 6-8 нуклеотидов, расположенная непосредственно перед инициирующим кодоном АУГ, определяет эффективность трансляции. Эта последовательность представляет собой участок связывания мРНК с рибосомой. Как правило, он отстоит на 8 нуклеотидов от инициирующего кодона, и его сдвиг в ту или иную сторону может резко снижать эффективность трансляции соответствующей мРНК. Описанный участок называется последовательностью Шайна-Дальгарно, по имени исследователей, впервые его идентифицировавших.

В состав вектора кроме всего прочего должен входить маркерный ген, позволяющий селектировать измененные клетки. Часто в качестве селективных используют широко распространенные в природе гены ферментов, модифицирующих антибиотики и инактивирующие их действие.

 

Читать дальше ► регуляция эукариотических генов

Другие главы раздела:


Реклама

написать письмо автору © 1995-2013 Наталья Кузьмина