биотехнология, учебник

Содержание главы:


Разделы учебника:


Реклама

Раздел "Культуры животных клеток и тканей"

Гибридизация животных клеток

Механизм слияния клеток

Для индукции слияния клеток используются вещества различной природы. Ионы Са2+, полиэтиленгликоль, лизолецитин, моноолеат глицерина, вирус Сендай.
Лизолецитин - поверхностно-активное вещество липидной природы, продукт деградации лецитина путем обработки последнего фосфолипазой А. Лизолецитин повреждает мембраны и токсичен для живых систем. Цитотоксический эффект этого вещества можно уменьшить снижая его концентрацию или добавляя во время обработки альбумин.
Моноолеат глицерина также соединение липидной природы, но его повреждающее действие менее выражено, а частота слияния клеток при применении этого вещества возрастает в 4-7 раз по сравнению со спонтанным процессом. К другим агглютинирующим агентам, способность которых вызывать слияние клеток, была исследована специально, относятся лектины растений и антитела.
Преимущество вируса Сендай как сливающего агента заключается в полном отсутствии цитотоксического эффекта. Вирус перед употреблением инактивируют, облучая ультрафиолетовой лампой в течение 5 минут, при этом он теряет способность к размножению, но сохраняет способность сливать клетки. Вирус Сендей имеет два недостатка:
- необходимость наращивать, титровать, концентрировать и инактивировать вирус;
- клетки растений и грибов не имеют рецепторов к этому вирусу, поэтому он неприменим для их гибридизации.
Первый этап слияния (рис. 32) - сближение мембран соседних клеток и установление между ними тесного контакта. Мембраны должны быть приближены друг к другу на расстояние в несколько ангстрем так, чтобы между ними стали возможны взаимодействия, подобные гидрофобным связям. Вызывают подобное сближение агенты, индуцирующие агглютинацию клеток. Миксовирусы, например, вирус Сендай, наряду с другими вирусами, которые не обусловливают слияния, прежде всего вызывают агглютинацию клеток, т.е. достаточно тесное их сближение, необходимое для успешного последующего слияния.
Полиэтиленгликоль также вызывает агрегацию клеток, хотя механизм действия его неизвестен. Возможно, благодаря тому, что в водном растворе ПЭГ несет небольшой отрицательный заряд, молекулы этого размера достаточно велики, чтобы между клетками возникали электростатические связи. Подтверждением этой гипотезы является усиление агглютинации клеток, вызываемой ПЭГ: двухвалентные ионы, по-видимому, образуют мостики между ПЭГ и отрицательно заряженными углеводами, находящимися на клеточной поверхности. Согласно другой гипотезе, протопласты сливаются в результате дегидратации. Поглощение воды индуцирует образование пор на поверхности мембраны и происходит перетекание внутриклеточного материала. После слияния участки с порами сохраняются некоторое время. Существует два предположения, объясняющие возникновение пор :
1. При высокой концентрации ПЭГ (20 - 30%) вся свободная вода поглощается им, вызывая разрывы в мембране;
2. ПЭГ уменьшает полярность воды, что вызывает перераспределение полярных и гидрофобных компонентов мембраны, стабилизирующих липидные слои.
С особым успехом для этих целей используется ПЭГ с молекулярным весом от 1500 до 7500.

Рис. 32. Этапы слияния клеток (по Н. Рингертцу, Р. Сэвиджу, 1979):


А - 1-й этап, сближение цитоплазматических мембран: 1- гликопротеиды, 2 – липиды, 3 – плазматические мембраны, 4 – митохондрии, 5 – микрофиламенты, 6 – частицы вируса Сендай;
Б - 2-й этап, выход гликопротеидов и обнажение липидных слоев мембраны;
В - 3-й этап, образование мицелл;
Г - начало 4-го этапа, слияние мембран, образование цитоплазматических мостиков.


Лектины и антитела - двух- или поливалентные соединения, и их агглютинирующая функция связана со способностью одной молекулы какого-либо из этих соединений взаимодействовать с рецепторами, находящимися на поверхности двух клеток, что и приводит к образованию связи между клетками. Достаточное количество таких молекулярных связей может удерживать клетки вместе, препятствуя их расхождению либо в результате броуновского движения, либо в результате электростатического отталкивания, либо в результате активной миграции клеток.
На втором этапе гликопротеиды, расположенные на поверхности, начинают высвобождаться из участков мембраны, лежащих между вирионами, и притягиваются к местам прикрепления вирусных частиц. Углеводные компоненты - наименее изученная часть клеточной поверхности. В мембранах они встречаются в виде нейтральных сахаров, а также ковалентно связываются с липидами или белками. Именно в таком виде они активно участвуют во многих биологических процессах. Установлено, что гликопротеиды определяют антигенную специфичность клеток, несут отрицательный заряд, характерный для клеток при физиологически нейтральных рН, принимают участие в распознавании и адгезии клеток, определяют рецепторные участки для вирусов, бактерий, агглютинирующих агентов, принимают участие в процессе регуляции проницаемости мембран для ионов. Эти свойства и определяют их участие в слиянии клеток.
Углеводы препятствуют слиянию клеток, так как разделяют липидные слои мембран, не давая им соприкасаться, так как на поверхности нормальной клетки рецепторные участки расположены редко или поодиночке. В результате трансформации вирусом происходит их объединение в группы. Гликопротеиды мигрируют в мембране к месту адсорбции вируса, оставляя свободными соседние участки, где и происходит слияние клеток. В некоторых случаях в удалении углеводных групп, препятствующих слиянию клеток, принимают участие лизосомные ферменты. При этом происходит соединение лизосом или пузырьков АГ с плазматической мембраной, и локальное высвобождение гликозидаз. Такая лизосомная активность может быть запрограммирована (в гаметах, миобластах, макрофагах, т.е. клетках, сливающихся в естественных условиях) или вызвана экспериментально при индуцированном слиянии клеток.
Третий этап - мицелизация обнажившихся липидов двух противолежащих мембран. Мицеллы - липидные капли, где молекулы липидов гидрофильными головками обращены к воде, а гидрофобные “хвосты” жирных кислот спрятаны внутрь. Этот процесс усиливается при высоких значениях рН и высокой концентрации ионов кальция. В обеих клетках начинается эндоцитоз вирусных частиц.
Четвертый этап - слияние мембран. Благодаря мостикам, образуемым Са2+, размер мицелл уменьшается. Под действием АТФ и Са2+, активизируются микрофиламенты. Возникший цитоплазматический мостик стабилизируется и расширяется благодаря функционированию микрофиламентов. На последних этапах слияния клеток важную роль играет наличие АТФ. АТФ образуется благодаря деятельности митохондрий. Поликарионы, образующиеся при слиянии двух или трех клеток, представляют собой не бесформенные раздутые или двулопастные шары цитоплазмы, а принимают форму, характерную для одной из родительских клеток или промежуточную между ними. Форму клетки определяют микротрубочки и микрофиламенты. В процессе слияния клеток микрофиламенты актиномиозинового типа, расположенные под цитоплазматической мембраной, принимают непосредственное участие, так как обеспечивают объединение цитоплазм слившихся клеток и стабилизацию вновь образованной системы. Однако, формирование цитоскелета - энергозависимый процесс, требующий большого количества АТФ. Видимо, этим обусловлено присутствие митохондрий в местах слияния клеточных мембран.

Читать дальше ► моноклональные антитела (МКА)

Другие главы раздела:


Реклама

написать письмо автору © 1995-2013 Наталья Кузьмина